摘要：通过研究鸡源性乳酸菌表面自凝集和与大肠杆菌互凝集的特性，探讨其对鸡肠道环境生长的适应性。按照常规方法分离鉴定鸡源性乳酸菌，并通过凝集试验检测自凝及其与致病菌大肠杆菌的互凝特性。结果显示从肉鸡中分离筛选出3株鸡源性益生菌；初期3菌株之间的自凝能力随培养时间的增长而凝集能力增强，其互凝率也随时间的增长而增强，并且自凝率高的菌株，对应的互凝率偏高。这表明体外培养时间可能影响鸡源性乳酸菌自凝及其与致病性大肠杆菌相互凝集性能。
关键词：鸡源性益生菌；分离鉴定；凝集特性
益生菌是由一种或几种有益的微生物及其代谢产物组成的可供人或动物直接使用的活菌制剂，又称活菌剂、微生态制剂、促生素、生菌素等[1]。但由于在加工、保存、运输和使用过程中活菌制剂易失活，且机体内部酸碱环境对其有发生作用，致其不能充分发挥作用。故筛选益生菌菌株时最好来自同源动物。益生菌在肠道内黏附性能是判断其能否发挥功效的一项重要指标。黏附性能既是益生菌在肠道内定植的先决条件，又是益生菌发挥其对宿主有益的生理、生化作用的基础[2]。大量研究结果表明，菌体的黏附能力与其表面凝集能力呈正相关[3—4]。此外对致病菌的凝集作用也是肠道益生菌的一个重要特征。本文从健康肉鸡肠道中分离、筛选、纯化鸡源性乳酸菌，并对其进行生化鉴定、自凝集能力和对致病菌大肠杆菌互凝集能力进行了研究，现报道如下。
1 材料与方法
1.1试验材料
1.1.1试验动物
选用健康成年肉鸡。
1.1.2试剂
MRS培养基：蛋白胨10g/L,牛肉浸粉5g/L,酵母浸粉4g/L，葡萄糖20g/L，磷酸氢二钾2g/L，柠檬酸三铵2g/L,醋酸钠5g/L,硫酸镁0.2g/L,硫酸锰0.05g/L,琼脂15g/L,吐温80 1g/L
MRS液体培养基：蛋白胨10g/L,葡萄糖20g/L,酵母粉4g/L,牛肉粉5g/L,硫酸锰0.05g/L,硫酸镁0.2g/L,磷酸氢二钾2g/L,乙酸钠5g/L,吐温80 1g/L,柠檬酸三铵2g/L。
碳酸钙、革兰氏染液、PBS缓冲液、生化发酵管均从市场购买
1.1.3致病菌
1株致病性大肠杆菌O78，由河北工程大学课题组提供。
1.1.4主要仪器
显微镜，培养箱、紫外可见分光光度计，高速离心机
1.2方法
1.2.1菌种的分离
从健康鸡盲肠中刮取黏膜和内容物各1g，置于盛有9ml无菌生理盐水中，充分震荡摇匀，然后吸取0.5ml菌液置于4.5ml无菌生理盐水的试管中，此稀释度为10-1。重复以上过程，依次制成10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7的菌液，选择10-5、10-6、10-7三个梯度的菌液吸取0.lml菌液分别滴于MRS培养基平板上，37℃培养24一48h挑取形态不同的菌落镜检，分别在其选择培养基上划线接种做纯培养，而后置于4℃冰箱保存备用。
1.2.2菌种形态观察
采用革兰氏染色法染色，然后镜检。
1.2.3生化试验
革兰氏阳性兼性厌氧无芽孢杆菌的试验项目包括：过氧化酶试验、硝酸盐还原试验、明胶液化试验、吲哚试验、硫化氢试验、糖发酵试验，37℃培养24h。试验结果与《伯杰氏细菌鉴定手册》对照进行综合判定，如均为阴性，则可初步定为乳酸杆菌属。
革兰氏阳性兼性厌氧球菌的试验项目包括：细胞形态学检查，葡萄糖产酸产气试验、10℃, 45℃，60℃ 30min生长试验，pH9.2 和 pH9.6生长试验，4%NaCl,，6.5%NaCl生长试验，根据上述试验结果进行初步鉴别。
在各类初步鉴定后，进行生化发酵管进行属种的鉴定，生化管种类有：乳糖、蔗糖、麦芽糖、葡萄糖、葡萄糖酸盐、纤维二糖、七叶苷、果糖、阿拉伯糖、甘露糖、密二糖、松三糖、精氨酸脱羧酶，结果与《常见细菌系统鉴定手册》和《乳酸细菌的分类鉴定与实验方法》对照，进行鉴定。
1.2.4凝集试验方法
参照文献[5]的方法做凝集试验。
1.2.4.1菌体的处理
在无菌条件下操作，将菌种接种至MRS液体培养基中，接种量为1%，30℃有氧条件培养24h，菌液通过4000 r/min 离心15min收集菌体，菌体用pH=7.2的PBS清洗2次，然后重悬于PBS，用紫外分光光度计调整菌悬液在波长600nm处的吸光度A600在0.25±0.05范围内。致病菌菌体处理方法采用同样方法。
1.2.4.2菌体自凝集
吸取4 ml已调整吸光度的菌悬液加入至无菌试管中，静置于室温下，分别在0、2、4、6、8、10、20、24、36、48h时测定该菌悬液在波长600nm处的吸光值。自凝集率（A%）计算公式：A%=（A0-At）/A0×100。式中A0为0h的吸光光度值，At为不同时间点的吸光光度值。
1.2.4.3菌体对致病菌的凝集
吸取2 ml菌种菌悬液和2 ml致病菌菌悬液于无菌试管中，混匀，室温下静置，分别在0、2、4、6、8、10、20、24、36、48h时测定其在波长为600nm处的吸光值。对致病菌的凝集率（A%）计算公式：A%=（1-Amix/A0）×100 计算。公式中Amix为致病菌与待测乳酸菌混合液在不同时间点的吸光值，A0为0h混合液的吸光值。
2、结果
2.1菌种的鉴定结果
2.1.1菌落特征及细菌形态特征
从加有碳酸钙的MRS培养基中选择产生溶钙圈的不同形态的菌落，最终从分离筛选出的7株菌中筛选得到以下3株菌，编号为B2、C2和L1，其菌落形态和镜检结果见表1。由表2、3可见，B2和L1为球菌；C2为杆菌。
表1益生菌的形态学结果
|
菌株 |
菌落形态 |
革兰氏染色 |
菌体形态 |
|
B2 |
乳白色菌落，圆形隆起，边缘
整齐，有溶钙圈 |
阳性 |
球菌，成对、成链排列，无芽孢 |
|
C2 |
白色半透明小菌落，圆形隆起，边
缘整齐，有溶钙圈 |
阳性 |
杆菌，两端钝圆，成对或成链状排列，无芽孢 |
|
L1 |
乳白色菌落，圆形隆起，边缘
整齐，有溶钙圈 |
阳性 |
球菌，成对、成链排列，无芽孢 |
2.1.2菌属的鉴定结果
由表2可见，C2为杆菌，过氧化酶试验、硝酸盐还原试验、吲哚试验、硫化氢试验均为阴性，明胶不液化，葡萄糖产酸不产气，因此这株菌鉴定为乳酸杆菌属的细菌。
表2 乳酸杆菌属的鉴定结果表
|
菌种 |
过氧化酶 |
硝酸盐还原 |
产生硫化氢 |
产生吲哚 |
明胶液化 |
葡萄糖 |
|
C2 |
- |
- |
- |
- |
- |
+ |
注：表中“+”表示90%以上菌株阳性，“一”表示90%以上阴性，“○”表示90%以上产气。
由表3可见，B2和L1经过硝酸盐还原试验检验均为阴性,且发酵葡萄糖产酸不产气,通常在10℃和45℃能生长， PH9.2和4%NaCl也可生长，可以初步鉴定为肠球菌属的细菌。
表3 肠球菌属的鉴定结果表
|
菌种 |
葡萄糖产酸产气 |
硝酸盐还原 |
10℃生长 |
45℃生长 |
PH9.2生长 |
4%NaCl生长 |
|
B2 |
+ |
- |
+ |
+ |
+ |
+ |
|
L1 |
+ |
- |
+ |
+ |
+ |
+ |
注：表中“+”表示90%以上菌株阳性，“一”表示90%以上阴性，“○”表示90%以上产气。
2.1.3乳酸菌种的鉴定
通过与《常见细菌系统鉴定手册》、《乳酸细菌分类鉴定及实验方法》对照结果，鉴定表4中C2为短乳杆菌。
表4 C2乳酸杆菌属种的鉴定结果表
|
微量发酵管种类 |
乳糖 |
蔗糖 |
麦芽糖 |
葡萄糖 |
葡萄糖酸盐 |
纤维二塘 |
七叶苷 |
果糖 |
阿拉伯糖 |
甘露糖 |
密二糖 |
松三糖 |
15
℃
生
长 |
精氨酸脱羧酶 |
|
结果 |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
- |
+ |
+ |
+ |
- |
+ |
- |
+ |
+ |
注：表中“+”表示90%以上菌株阳性，“一”表示90%以上阴性。
通过与《常见细菌系统鉴定手册》、《乳酸细菌分类鉴定及实验方法》对照结果，鉴定表5中B2为粪肠球菌，L1为盲肠肠球菌。
表5 肠球菌属种的鉴定结果表
|
|
乳糖 |
蔗糖 |
麦芽糖 |
葡萄糖 |
甘油 |
山梨醇 |
果糖 |
阿拉伯糖 |
甘露糖 |
密二糖 |
松三糖 |
0.1%美兰牛乳 |
6.5%
NaCl |
|
B2 |
+ |
- |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
- |
+ |
- |
+ |
|
L1 |
+ |
+ |
+ |
+ |
- |
- |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
- |
注：表中“+”表示90%以上菌株阳性，“一”表示90%以上阴性。
2.2凝集试验的结果
2.2.1自凝集结果
菌株一般都有自凝现象，菌株的自凝集是指同一种菌株之间相互凝集形成多细胞簇现象。自凝集能力在益生菌中具有很重要的意义，益生菌菌株通过自凝集作用相互凝集到一定的数量进而达到菌株发挥益生功效所需的量，另一方面自凝集的作用使益生菌形成阻碍致病菌在肠道定植的屏障[2]。同时，菌体的黏附能力与其表面凝集能力也呈正相关关系。但与他人报道乳酸菌自凝变化有一定差异。
3株菌的自凝集结果见表6，由图表所示菌株在0-2h内自凝能力最快，当到达20h后，自凝率开始下降，甚至L1出现停滞自凝的现象。总体看，3株菌都有自凝的表现，其中C2的自凝能力更强，L1生物自凝能力最弱。
2.2.2对大肠杆菌的互凝结果
不同菌株之间产生的凝集作用称为互凝集作用。菌株和致病菌相互凝集的能力与抑菌能力的大小有着一定的关系。由表7可见，这3株菌对致病性大肠杆菌具有一定的凝集作用。其中C2菌株相对于其他两株菌的凝集能力要强，L1菌株则表现的相对弱一些。这与自凝能力的表现是一致的，由此可以反映出，自凝能力强的其互凝能力也很强。
3、讨论
近年来，随着微生态学的研究,人们渐渐认识到益生菌在防治某些动物疾病和促进动物生长发育方面的优越性，同时化学药品、抗生素引起的耐药菌株和畜禽产品中的残留及二重感染等问题也受到国际社会的普遍关注与担忧，益生菌在动物养殖业的应用开发研究范围越来越广泛[6-7]。
肠道菌群通过细菌黏附作用来实现定植，进入肠道后能否黏附在宿主肠道黏膜上皮细胞表面，形成稳定优势菌群，是保证益生菌应用效果的重要条件[8]。许多资料已经表明乳酸菌的凝集作用可促进阻止致病菌定植和感染的屏障形成[9-11] 。本试验从鸡肠道内分离出了粪肠球菌、盲肠肠球菌和短乳杆菌3株乳酸菌，发现不同种类鸡源性乳酸菌在体外培养过程中，其自凝及其与致病性大肠杆菌相互凝集性能有差异。故认为筛选益生菌菌种时，应为提高其在机体内发挥作用，应考虑其自凝及互凝性能。
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